桑树桑根腐病病原菌米根霉分离鉴定与催化蚕蛹油制备生物柴油

摘要：桑树病害种类很多,发生条件各异,症状也不相同，通常将桑树病害分为桑病毒病,桑真菌病和桑细菌病。而桑树根部病害主要有桑真菌病，桑细菌病和桑根结线虫病。目前,发现对桑树具有致病性的真菌有:桑蜜环菌属（Armillaria）、裂褶菌属(Schizophyllum)、桑卷担菌属（Hepcobasidium）、根霉属（Rhizopus）和镰霉菌属（Fusarium）。本探讨以一株桑树根部分离获得对桑树具有致病性的菌株，暂命名为TY.GF1。在32℃，该菌在PDA培养基上首先长出白色气生菌丝，呈棉絮状，菌落无定形，随后菌落转为灰黑色，病原菌2～3d内长满整个平板。培养3d后观察病原菌产生小刺球形孢子囊，有检测根,孢子囊球形或近球形，深褐色，孢囊孢子呈卵形或球形或近似球形，大小不等，淡褐色。同时运用核糖体18S rDNA和ITS区基因分子策略进一步鉴定。利用真菌通用引物扩增了出18S rDNA和ITS区基因片段，经测序，大小分别为1805bp和627bp。将获得的基因序列分别提交到GenBank数据库，并在NCBI中blast，选取同源性较高的序列构建系统进化发育树。结合形态特点和基因序列浅析，将TY.GF1菌株鉴定为米根霉。通过罗丹明B平板对米根霉的发酵液的快速鉴定，确定TY.GF1野生菌株能够产生脂肪酶。本探讨通过不同碳源（葡萄糖、麸皮、果糖、红糖、蔗糖、桑粉、淀粉、麦芽糖和大豆油）、氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸钠、玉米粉和硫酸铵）、诱导物（大豆油、麻油、蓖麻油、橄榄油、芥花籽油、葵花籽油、蚕蛹油和菜籽油）、温度（25～45℃）、pH值（4～9）、产酶时间（12～96h）、表面活性剂（曲拉通X-100、吐温-20、吐温-80、聚丙二醇和十二烷基硫酸钠）的单因素筛选，选取8个可疑因素利用Placket-Burman作重要因素筛选，确定了麦芽糖、蛋白胨和芥花籽油为对全细胞酶活影响较大的重要因素，并用Box-Behnken确定各因素最佳响应值，得出最适反应系统为：麦芽糖2.08g/L,蛋白胨21.58g/L，芥花籽油12.73g/L，吐温-800.1%（v/v），NaNO_31.2g/L，KH_2PO_41.2g/L，MgSO_47H_20，温度35℃，摇床转速130rpm。在该条件下，全细胞最大酶活预测值为278.154U/g，验证值为272.5U/g。对脂肪酶的前提基因和成熟基因进行了扩增和测序,分别获得了片段长度为1101bp和810bp的片段,将获得的前体序列提交到GeneBank，登录号为JN689988。序列浅析表明，无内含子，分别编码366个氨基酸和269个氨基酸，成熟脂肪酶的结构域在SDGGKVVAAT序列上。理化性质预测浅析表明，成熟脂肪酶的分子式为C_(1335)H_(2056)N_(350O396)S_7，分子量为29569.5，论述等电点为8.14，消光系数为1.163～1.175；发现前体脂肪酶的分子式为C_(1758)H_(2729N469O547)S_(10)，分子量为39507.4，论述等电点为7.15，消光系数为1.123～1.132。且二者都是疏水的。在叔丁醇介质系统下，TY.GF1全细胞催化蚕蛹油制备生物柴油最佳反应条件为35℃，转速为130rpm，蚕蛹油6.5g，全细胞添加量为0.8g，水含量为油重的3%，甲醇1.05g，叔丁醇体积比为1.5:1，反应24h后，生物柴油得率可达到80%以上。在无助溶剂反应系统中，虽然采取了分步添加甲醇的方式来避开甲醇对全细胞的负面影响，但全细胞在重复利用历程中稳定性较差，在第五次的时候，全细胞酶失活，而在叔丁醇介质系统中，反应九次之后，全细胞相对酶活力仍然能达到67%。关键词：桑树病害论文分类鉴定论文米根霉论文脂肪酶论文生物柴油论文

摘要6-8

Abstract8-10

目录10-13

Contents13-16

第1章 绪论16-30

1.1 桑树根部病害探讨进展和选题作用16-17

1.2 人工接种苗期致病性测定策略17

1.2.1 土壤接种法17

1.2.2 根部切伤接种法17

1.2.3 蘸根接种法17

1.3 病原菌检测技术探讨进展17-20

1.3.1 传统植物病原菌检测技术17-18

1.3.2 免疫学检测技术18

1.3.3 分子生物学检测技术18-20

1.4 根霉脂肪酶20-24

1.4.1 脂肪酶的催化机理21-22

1.4.2 脂肪酶的底物特异性22-23

1.4.3 脂肪酶酶活力测定策略23-24

1.5. 生物柴油24-27

1.5.1 生物柴油探讨背景24-25

1.5.2 生物柴油生产策略25-27

1.6 脂肪酶其他工业上的运用27-28

1.6.1 脂肪酶在食品工业中的运用27

1.6.2 脂肪酶在有机合成中的运用27

1.6.3 脂肪酶在造纸工业中的运用27-28

1.6.4 脂肪酶在日用化工中的运用28

1.6.5 脂肪酶在酿酒工业中的运用28

1.7 本探讨主要内容28-30

第2章 桑根腐病病原菌的分离及鉴定30-44

2.1 实验材料30-32

2.1.1 供试植株品种30

2.1.2 载体、酶、宿主菌和主要试剂30

2.1.3 常用溶液、缓冲液和培养基的配制30-32

2.1.4 主要实验仪器和设备32

2.1.5 数据浅析软件32

2.2 实验策略32-36

2.2.1 TY.GF1 的分离和培养32

2.2.2 致病性测定32-33

2.2.3 形态学观察33

2.2.4 基因序列克隆的常规策略33-36

2.2.5 数据浅析36

2.3 实验结果36-40

2.3.1 TY.GF1 的致病性及主要症状36-37

2.3.2 TY.GF1 的形态特点37-38

2.3.3 18S rDNA 和 ITS 序列扩增与序列同源性浅析38-40

2.4 讨论40-44

2.4.1 TY.GF1 的致病性40-41

2.4.2 TY.GF1 的分离41

2.4.3 TY.GF1 的鉴定41-44

第3章 米根霉全细胞酶活的优化44-54

3.1 实验材料44

3.1.1 菌种44

3.1.2 仪器44

3.1.3 试剂及溶液44

3.2 实验策略44-45

3.2.1 粗酶液及全细胞准备44

3.2.2 平板定性检测44-45

3.2.3 脂肪酶活力测定45

3.2.4 数据浅析45

3.3 实验结果45-53

3.3.1 平板定性检测45

3.3.2 单因素筛选45-49

3.3.3 Plackett–Burman 设计筛选产酶主效因子49-50

3.3.4 最陡爬坡实验及响应曲面浅析50-53

3.4 讨论53-54

第4章 脂肪酶序列的扩增及浅析54-60

4.1 实验材料54

4.1.1 材料54

4.1.2 实验仪器54

4.2 实验策略54

4.2.1 引物设计54

4.2.2 扩增目的基因54

4.2.3 蛋白序列浅析54

4.3 实验结果54-58

4.3.1 米根霉脂肪酶序列的扩增及浅析54-55

4.3.2 理化性质浅析55-58

4.4 讨论58-60

第5章 米根霉全细胞催化蚕蛹油制备生物柴油60-68

5.1 实验材料与策略60

5.1.1 实验材料及实验试剂60

5.1.2 实验仪器60

5.2 实验策略60-61

5.2.1 蚕蛹油制备60

5.2.2 蚕蛹油平均分子量计算60

5.2.3 气相浅析条件60-61

5.2.4 标准曲线制作61

5.2.5 完全甲酯化试样的制备与测定61

5.2.6 产率的计算61

5.2.7 生物柴油反应系统61

5.3 实验结果61-67

5.3.1 生物柴油样品浅析61-62

5.3.2 标准工作曲线与线性回归浅析62

5.3.3 生物柴油反应系统优化62-67

5.4 讨论67-68

结论68-70