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摘要：皮肤恶性黑素瘤(CMM)因其易转移、对细胞物耐受等特点而被认为是最具侵袭性和致死率最高的肿瘤之一。近年来该病的发病率和死亡率持续增高,但仍没有理想的治疗药物。由此,寻求治疗黑素瘤的新型药物十分必要。雷公藤内酯醇及丹皮酚作为具有多种药理活性的中药单体,已在多项探讨中被证实具有抗肿瘤作用,但抗黑素瘤的作用尚未见报道。本探讨旨在探讨此两种中药单体在抗黑素瘤方面发挥的作用及其机制。(1)丹皮酚和雷公藤内酯醇对黑素瘤细胞增殖的影响利用CCK8策略检测了药物作用后对黑素瘤A375和M14细胞增殖抑制率的影响,并用PI染色-流式细胞术检测了药物对两种黑素瘤细胞细胞周期的影响。结果显示,0.5mM,1mM,2mM,4mM,8mM丹皮酚作用24,48,72h均对A375细胞有抑制作用,各时间点的半数抑制浓度(IC50)分别约为5.19mmM,1.50mM和1.09mM；丹皮酚对M14细胞24,48和72h的半数抑制浓度(IC50)分别约为4.11mM,1.60mM和1.17mM；且可以将细胞阻滞在G2/M期。12.5nM,25nM,50nM,100nM雷公藤内酯醇作用24,48,72h对A375细胞也均有抑制作用,其IC50分别约为84.46nM,33.00nM和8.53nM；雷公藤内酯醇对M14细胞24、48和72h的半数抑制浓度(IC50)分别约为130.90nM,35.90nM和6.50nM；而雷公藤内酯醇是将细胞阻滞在S期。(2)丹皮酚和雷公藤内酯醇对黑素瘤细胞凋亡的影响利用Hoechst33258染色,荧光显微镜下观察细胞的形态,以流式细胞术检测药物作用下细胞的凋亡率变化。结果表明,分别以5mM丹皮酚作用24h,或30nM雷公藤内酯醇作用48h后,黑素瘤A375和M14细胞均出现凋亡的形态学变化。以0,1.25,2.5,5mM丹皮酚作用24h后,A375细胞的早期凋亡率分别为3.11%±0.53%,13.74%士1.73%,25.95%±0.57%和46.44%±0.81%；M14细胞的早期凋亡率则分别为1.00%±0.08%,2.00%±0.01%,2.99%±0.29%和14.73%±0.94%,各作用组与对照组相比均有统计学作用(P0.05)。0nM,10nM,20nM,30nM雷公藤内酯醇作用48h后,A375细胞的凋亡率分别为4.20%±0.09%,19.50%±0.32%,36.57%±3.85%和58.68%±2.03%；M14细胞的早期凋亡率则分别为2.92%±0.17%,20.99%±0.40%,34.28%±2.04%和63.38%-±0.71%,各作用组与对照组相比均有统计学作用(P0.05)。两种化合物诱导凋亡作用均呈剂量依赖联系。(3)丹皮酚和雷公藤内酯醇对黑素瘤细胞凋亡机制的探讨在上面陈述的(1)和(2)中,观察到A375细胞对丹皮酚和雷公藤内酯醇的诱导凋亡作用较M14细胞敏感,为此在本部分实验中,选择A375细胞进行药物诱导黑素瘤细胞凋亡机制的相关探讨。本部分实验中检测了caspase3, caspase8和caspase9活性的变化,并利用Western Blot测定p53和NF-κB及其相关蛋白水平的变化。实验结果显示,1.25mM,2.5mM,5mM丹皮酚作用于黑素瘤细胞株A375细胞24h后,caspase3、caspase8及caspase9的活性均发生具有统计学作用的升高；p53及Bax的蛋白水平随药物浓度的增加而升高,而NF-κB、Bcl-2、Bcl-XL的蛋白水平随药物浓度增加而降低,表明丹皮酚对黑素瘤A375细胞的促凋亡作用不仅通过caspase和NF-κB通路,还通过激活p53通路诱导凋亡。以10nM,20nM,30nM雷公藤内酯醇作用于黑素瘤A375细胞株48h后,caspase3和caspase9的活性随浓度的升高而增加,而caspase8的活性则随浓度的升高而略有下降；NF-κB、Bcl-2、 Bcl-XL的蛋白水平随药物浓度增加而降低,表明雷公藤内酯醇仅通过caspase和NF-κB通路诱导黑素瘤A375细胞凋亡。(4)丹皮酚和雷公藤内酯醇对黑素瘤细胞侵袭的影响及其机制的探讨侵袭、转移是恶性肿瘤最本质的特性。本探讨采取细胞划痕实验及transwell实验,观察药物对A375细胞侵袭性和迁移能力的影响,结果表明,两种中药单体均对黑素瘤A375和M14细胞具有抑制侵袭的作用。以1.25mM丹皮酚作用24h后,A375细胞的迁移距离由对照组的197.00±11.14缩短至46.67±5.69,M14细胞的迁移距离则由对照组的172.67±9.29缩短至33.00±6.24,药物作用组与对照组结果比较差别均具显著统计学作用(P0.01)；分别以1.25mM,2.5mM,5mmM丹皮酚作用24h后,穿过人工基底膜的A375细胞数由对照组的180.67±13.65分别减少至131.67±10.41,74.33±3.21和33.33±4.16；穿膜的M14细胞数也由对照组的306.00±7.55依次减少至253.67±14.01,150.33±9.6和55.33±5.69,各组与相应对照组比均有显著统计学差别(P0.01)。10nM雷公藤内酯醇作用48h后,A375胞的迁移距离由对照组的286.67±17.62缩短至185.67±7.09,M14细胞的迁移距离则由对照组的415.67±19.76缩短至213.33±10.02,药物作用组与对照组结果比较差别均具显著统计学作用(P0.01)；分别以10nM,20nM,30nM雷公藤内酯醇作用48h后,穿过人工基底膜的A375细胞数由对照组的183.00±10.82分别减少为143.67±7.77,60.67±4.04和27.33±2.52；穿膜的M14细胞数也由对照组的129.67±7.23减少至80.33±2.51,65.00±5.00和20.33±1.53,各组与相应对照组比均有显著统计学差别(P0.01)。本探讨以Western Blot、Real-time PCR检测uPA和VEGF的基因表达和蛋白水平的变化,以探讨这两种药物影响人黑素瘤肿瘤细胞侵袭性和迁移能力的可能的机制,结果表明,丹皮酚对uPA和VEGF的基因表达量随浓度增加逐渐升高：0mM(对照组),1.25mM,2.5mM和5mM的结果分别为uPA：0.20±0.02,0.28±0.01,0.38±0.01和1.97±0.21；VEGF:0.59±0.06,0.79±0.04,2.27±0.02和3.61±0.21,而uPA和VEGF的蛋白水平显著降低,0mM(对照组),1.25mM,2.5mM和5mM组的uPA表达与β-actin的灰度比值分别为1.01、0.89、0.68、和0.46,其VEGF表达与β-actin的灰度比值分别为1.13、1.00、0.92和0.52。雷公藤内酯醇对uPA和VEGF的基因表达量随浓度增加逐渐升高：0nM(对照组),10nM,20nM和30nM的结果分别为uPA：0.20±0.02,0.41±0.00,0.95±0.05和5.84±0.16；VEGF:0.59±0.06,0.45±0.11,0.89±0.08和1.00±0.03,而uPA和VEGF的蛋白水平显著降低,0nM(对照组),10nM,20nM和30nM组的uPA表达与β-actin的灰度比值分别为1.01、0.81、0.44和0.15,其VEGF表达与β-actin的灰度比值分别为1.13、1.46、1.34和0.96。表明丹皮酚和雷公藤内酯醇可能通过降低VEGF和uPA的蛋白水平而抑制黑素瘤细胞的侵袭。结论丹皮酚和雷公藤内酯醇均可以抑制人黑素瘤细胞A375和M14增殖,其中丹皮酚的抑制机制可能与抑制黑素瘤细胞在G2/M周期阻止细胞有丝分裂有关,而雷公藤内酯醇的作用机制可能与抑制细胞在S期抑制细胞DNA复制有关。丹皮酚和雷公藤内酯醇能剂量依赖性地诱导人黑素瘤A375和M14细胞凋亡。其中雷公藤内酯醇通过caspase和NF-κB通路诱导人黑素瘤细胞凋亡；而丹皮酚不仅通过caspase和NF-κB通路,还通过激活p53通路诱导黑素瘤A375细胞凋亡。丹皮酚和雷公藤内酯醇均可通过抑制VEGF和uPA的蛋白表达抑制黑素瘤细胞的侵袭和迁移。丹皮酚和雷公藤内酯醇均具有抗黑素瘤的作用,具有皮肤黑素瘤治疗新药的研发前景。关键词：丹皮酚论文雷公藤内酯醇论文黑素瘤论文凋亡论文侵袭论文
英文缩略词5-7
前言7-12
实验流程12-13
全文摘要13-16
英文摘要16-19
第一章 ：丹皮酚和雷公藤内酯醇对黑素瘤细胞增殖的影响19-47
摘要19
Abstract19-20
引言20
材料与策略20-22
结果22-44
讨论44-45