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靶向靶向免疫细胞脂质载体电大

收藏本文 2024-03-25 点赞:4013 浏览:10971 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:在过去几十年的脂质体有各种医疗运用,包括分子成像,药物输送,以及靶向性治疗。脂质体表面积大,结构具有弹性,有很大的修饰改良的潜力,其在体内的药代动力学体现出独特的性质。传统脂质体易被网状内皮系统吞噬,通过EPR效应实现被动靶向到肝脏,肺等特定组织;长循环脂质体经过高亲水双性分子的修饰,使得脂质体能够逃避RES的吞噬,延长其在血液中的循环时间,增加药物释放时间和作用时间,但缺乏靶向性,需要对脂质体表面进行额外的靶向配体修饰。目前,针对淋巴细胞的的靶向脂质体探讨甚少,而在多种疾病中,治疗的失败往往是由于淋巴系统中隐匿的病灶,由于淋巴系统不同于其他身体器官,使得常规脂质体不能达到有效药物剂量,又或者因为限制性毒性不能达到治疗效果。本探讨的重点是采取人工筛选的靶向配体多肽或者由免疫细胞自身剪切的多肽,对淋巴细胞形成靶向,构建淋巴系统靶向的脂质体,使其特异性的作用于淋巴细胞,达到治疗或者预防的效果。在人工筛选多肽配体的脂质体探讨中,我们根据CD40/CD40L这一对与自身免疫疾病相关的通路,针对CD40L设计多肽配体,期望借助这配体实现对CD40/CD40L信号通路的阻断,同时对此通路中过度活跃的T细胞实现靶向杀伤。而隐形脂质体作为多肽配体展示以及细胞毒性药物的载体已经有大量的探讨,我们结合筛选到的特异性配体,辅以细胞毒性药物,利用脂质体作为两者的载体,使其同时能够完成通路阻断和T细胞靶向杀伤的效果。我们利用计算机辅助模拟,确定受体和配体作用位点,筛选出具有与配体结合潜能的候选肽。后续利用表面等离子共振技术,对计算机虚拟筛选得到的候选多肽进行分子层面筛选。如此得到的多肽,我们再进行细胞层面的结合力筛选,最终确定个靶向多肽来进行CD40L+T细胞靶向毒性的体外和体内实验。实验结果表明,此多肽修饰的脂质体确实可以介导体外CD40L+T细胞的靶向杀伤,同时在对CD40/CD40L信号通路过度活化造成的动物疾病模型的治疗中,多肽修饰的脂质体与非靶向脂质体相比也体现出了较好的治疗效果。在天然表位肽制备脂质体的探讨中,我们利用抗原呈递细胞中MHC-II类分子呈递抗原的历程,将抗原蛋白自然剪切成T细胞表位多肽。目前的探讨,只能通过人工洗脱得到这些肽段或者计算机模拟后经过化学合成得到表位肽,费时费钱。而我们的探讨则将此天然剪切的T细胞表位肽作为整体,通过脂质体重新组装抗原呈递细胞上含有MHC-II分子和表位肽的膜片段,考察这复杂的黑箱系统是否能对下游T细胞进行活化,引起机体的免疫反应。由于脂质体是膜蛋白的良好载体,所以利用脂质体可以很好的保持MHC-II分子和表位肽的生物活性,同时脂质体还是个类细胞系统,使得其装载细胞膜片段后能够实现部分膜蛋白的功能。在此项探讨中,我们利用OVA作为方式抗原蛋白,树突状细胞作为方式抗原呈递细胞,通过体外活化的策略使得OVA经过自然剪切产生OVA表位肽,而此表位肽是与树突状细胞上的MHC-II分子结合在一起的。后续提取这表位肽/MHC-II复合物,利用脂质体作为载体,制成靶向CD4+T细胞的表位肽免疫脂质体。该脂质体在体外可以推动MF2.2D9T细胞株分泌IL-2,并且诱导原代CD4+T细胞增殖。将其回输体内,可以引起OVA特异性的体液免疫。经此脂质体免疫后的小鼠,可具有针对OVA的抗肿瘤特性,经浅析该抗肿瘤效果是体液免疫和细胞免疫的共同作用结果。说明我们制备的自然剪切的表位肽T细胞靶向脂质体保持了定免疫学活性,并且可以作为种预防性肿瘤疫苗利用。关键词:多肽论文靶向论文表位论文脂质体论文自身免疫疾病论文肿瘤免疫论文

    摘要3-6

    ABSTRACT6-10

    目录10-13

    第一章 前言13-57

    1. T 细胞靶向药物开发13-36

    1.1 T 细胞介绍和分类13-15

    1.2 T 细胞的功能15-20

    1.3 T 细胞活化通路20-30

    1.4 T 细胞与相关疾病30-36

    2. 脂质体作为药物载体的探讨36-49

    2.1 脂质体介绍36-37

    2.2 脂质体运用37-42

    2.3 脂质体的制备42-49

    3. 多肽作为靶向性配体的探讨进展49-57

    3.1 多肽的概念49-50

    3.2 肽的药物可开发性50-52

    3.3 肽类药物的研发方向52-57

    第二章 CD40L+ T细胞靶向配体筛选和鉴定57-91

    1. 前言57-63

    1.1 CD40L 的蛋白结构57-60

    1.2 计算机模拟分子对接60-62

    1.3 表面等离子共振技术62-63

    2.材料与策略63-72

    2.1 材料与仪器63-66

    2.2 实验策略66-72

    3. 实验结果72-88

    3.1 CD40L 多肽配体的计算机筛选72

    3.2 CD40L 候选多肽配体的 SPR 筛选72-73

    3.3 多肽脂质体的制备和表征73-75

    3.4 各种细胞上 CD40L 的表达检测75-79

    3.5 JD6 多肽荧光脂质体与各种细胞的结合实验79-88

    4. 浅析和讨论88-91

    第三章 CD40L靶向多肽的活性考察91-124

    1. 前言91-95

    1.1 CD40/CD40L 信号通路介绍91

    1.2 CD40/CD40L 信号通路靶向配体91-92

    1.3 CD40L 与相关疾病动物模型92-93

    1.4 甲氨蝶呤(MTX)对 EAE 的治疗93-95

    2. 材料与策略95-105

    2.1 材料与仪器95-98

    2.2 实验策略98-105

    3. 实验结果105-120

    3.1 CD40L 配体多肽 JD6 介导的体外靶细胞转染105-107

    3.2 小动物光学活体成像系统测量 JD6 的体内分布107-109

    3.3 靶向多肽甲氨喋呤脂质体的表征109-113

    3.4 靶向多肽甲氨蝶呤脂质体体外细胞毒性113-114

    3.5 EAE 小鼠模型的建立114-115

    3.6 靶向多肽甲氨蝶呤脂质体治疗 EAE 实验115-120

    4. 浅析与讨论120-124

    第四章 T细胞表位脂质体的制备和纯化124-161

    1. 前言124-128

    1.1 肿瘤抗原表位多肽124-125

    1.2 脂筏的结构和功能125-126

    1.3 树突状细胞与脂筏126-128

    2.材料与策略128-141

    2.1 材料与仪器128-134

    2.2 实验策略134-141

    3. 实验结果141-156

    3.1 骨髓诱导树突状细胞的建立141-143

    3.2 树突状细胞荷载抗原蛋白后表面分子表达143-144

    3.3 树突状细胞脂筏的提取和表征144-149

    3.4 T 细胞表位脂质体的制备和表征149-156

    4. 讨论与浅析156-161

    第五章 T细胞表位脂质体免疫学活性考察161-195

    1. 前言161-165

    1.1 CD4+ T 细胞与肿瘤免疫治疗161-162

    1.2 体液免疫产生的抗体与肿瘤治疗162-164

    1.3 细胞免疫的 CTL 效应与肿瘤治疗164-165

    2.材料与策略165-176

    2.1 材料与仪器165-168

    2.2 实验策略168-176

    3. 实验结果176-191

    3.1 OVA 乳剂免疫小鼠效果176-177

    3.2 T 细胞表位脂质体促 MF2.2D9 分泌 IL-2 实验结果177-181

    3.3 T 细胞表位脂质体促原代 CD4+ T 细胞增殖实验181-184

    3.4 T 细胞表位脂质体促小鼠针对 OVA 的体液免疫水平184-187

    3.5 T 细胞表位脂质体免疫小鼠抗肿瘤实验187-189

    3.6 T 细胞表位脂质体抗 EG.7 肿瘤的体液免疫机制189-190

    3.7 T 细胞表位脂质体抗 EG.7 肿瘤的细胞免疫机制190-191

    4. 浅析与讨论191-195

    第六章 总结与展望195-200

    1. 探讨内容195-196

    2. 革新点196-198

    3. 探讨展望198-200

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