分析表达PB1和EGFR重组表达与药物体外筛选期刊

摘要：蛋白酶体是分布于真核细胞中的一类多亚基蛋白酶复合物，它在胞内蛋白质降解的泛素-蛋白酶体通路中起着关键性的作用。重组表达蛋白酶体的活性亚基可以用于体外筛选、寻找具有蛋白酶体抑制剂作用的化合物。本探讨利用原核表达系统（pET28a(+)）构建人蛋白酶体亚基PB1重组体，实现了PB1在大肠杆菌BL21(DE3)内的可溶性表达。采取IMAC亲和层析对PB1重组蛋白进行纯化，纯度可达到95%以上，通过BIAcore浅析，筛选出潜在的具有蛋白酶体抑制剂活性的化合物。具体探讨内容和结果如下：将人源蛋白酶体亚基（PB1）的cDNA编码序列（全长726bp）与原核表达载体pET28a(+)连接，构建重组表达载体pET28a-PB1，经大肠杆菌BL21(DE3)转化后，用1mM IPTG诱导表达，温度为20℃，过夜诱导，由此表达出了相对分子量约为27KD的目的蛋白，重组蛋白根据所带的His-Tag标签采取IMAC亲和层析柱来进行纯化，得到的目的蛋白纯度超过95%。重组蛋白经过胶内酶解后进入NanoLC-MS/MS系统检测，鉴定结果表明所表达的蛋白序列与NCBI提供的蛋白序列完全一致。在体外BIAcore实验浅析中，重组PB1蛋白对不同的化合物有着不同的结合能力，其中与雷公藤红素的结合能力较强，当雷公藤红素的浓度为10μM时，其与重组蛋白的结合力响应值达27RU，并且具有良好的浓度依赖型。这一部分内容为后续探讨建立了一种表达、纯化人源蛋白酶体亚基PB1的策略，并且可以运用于体外筛选潜在的蛋白酶体抑制剂。表皮生长因子受体（EGFR）是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，在抗肿瘤的分子靶向治疗方面有着重要作用。重组表达EGFR，可以用于体外筛选潜在的与EGFR有结合能力的活性化合物。本探讨中我们采取三种表达系统（原核、哺乳动物细胞及昆虫细胞）对EGFR胞外域进行了重组表达，以期获得具有生物活性的重组蛋白。具体探讨内容及结果如下：1.人表皮生长因子受体EGFR在原核（E. cop）表达系统中的表达将EGFR cDNA的编码序列（1857bp）与原核表达载体pET28a(+)连接，构建重组表达载体pET28a-EGFR，经大肠杆菌BL21(DE3)转化后，采取不同温度以及IPTG浓度来进行诱导，均未发现有显著蛋白条带。2. EGFR在哺乳动物细胞（CHO）表达系统中的表达将EGFR cDNA的编码序列（1857bp）与哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A连接，构建重组表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A-EGFR，转染CHO细胞，对照和转染组也未见有显著区别。3. EGFR在昆虫细胞（9）表达系统中的表达将EGFR cDNA的编码序列（1857bp）与昆虫细胞供体载体pFastBacHTb连接，构建重组供体表达载体pFastBacHTb-EGFR，供体质粒与病毒基因组同源重组后转染9细胞，收集第三代病毒进行蛋白表达。Western Blot验证有两条蛋白条带。一条在130KD，一条在D左右。进一步的大批量表达此蛋白以及重组蛋白的纯化和鉴定工作还在进行中。关键词：蛋白酶体论文表皮生长因子论文原核表达论文哺乳动物细论文胞表达论文昆虫细胞表达论文BIAcore论文体外筛选论文

摘要2-4

ABSTRACT4-8

第1章 文献综述8-18

1.1 原核表达系统9-11

1.1.1 大肠杆菌（Escherichia cop）-典型的原核表达系统9-10

1.1.2 枯草杆菌-可替代 E. cop 的原核表达系统10-11

1.2 真核表达系统11-16

1.2.1 酵母-最具有商业化价值的表达系统11-13

1.2.2 丝状真菌-另一具有商业价值的表达系统13

1.2.3 哺乳动物细胞表达系统-一个相对成熟的真核表达系统13-14

1.2.4 昆虫/杆状病毒表达系统-最具潜力的表达系统14-16

1.3 药物体外筛选16-17

1.4 主要的探讨内容、目的和作用17-18

第2章人蛋白酶体亚基 PB1 的重组表达、纯化及在蛋白酶体抑制剂筛选中的运用18-34

2.1 引言18

2.2 实验材料与策略18-26

2.2.1 实验材料18-20

2.2.2 实验策略20-26

2.3 结果与浅析26-32

2.3.1 PB1 基因的 PCR 扩增26-27

2.3.2 重组质粒 pET28a-PB1 的 PCR 和双酶切鉴定27-28

2.3.3 重组质粒 pET28a-PB1 的测序结果28

2.3.4 重组 PB1 蛋白的诱导表达28-29

2.3.5 重组蛋白的纯化29

2.3.6 NanoLC-MS/MS 浅析 PB1 重组蛋白29-31

2.3.7 重组蛋白 PB1 与雷公藤红素的体外结合31-32

2.4 本章小结32-34

第3章 表皮生长因子受体 EGFR 的重组表达34-58

3.1 引言34-35

3.2 实验材料与策略35-45

3.2.1 实验材料35-36

3.2.2 实验策略36-45

3.3 结果与浅析45-56

3.3.1 EGFR 胞外域 cDNA 的 PCR 扩增45-46

3.3.2 原核表达重组质粒 pET28a-EGFR 的鉴定46-47

3.3.3 重组 EGFR 蛋白在原核（E. cop）表达系统中的表达47-48

3.3.4 哺乳动物细胞表达重组质粒 pcDNA3.1/myc-His(-)A-EGFR 的鉴定48-49

3.3.5 重组 EGFR 蛋白在哺乳动物细胞（CHO）表达系统中的表达49-50

3.3.6 昆虫细胞重组表达质粒的鉴定50-52

3.3.7 重组 EGFR 蛋白在昆虫细胞（9）中的表达52-56

3.4 本章小结56-58

第4章 结论与展望58-60

4.1 蛋白酶体亚基 PB1 原核表达纯化及药物筛选58

4.2 表皮生长因子受体（EGFR）的重组表达结果58

4.3 展望58-60