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摘要：研究背景:突发公共卫生事件,是指突然发生,造成可能造成社会公众健康严重损害的重大传染病疫情、群体性不明原因疾病、重大食物和职业中毒以及其他严重影响公众健康的事件。现有传染病时有暴发和流行、已消灭或被控制的传染病死灰复燃以及新发传染病不断出现和暴发流行对公共卫生安全了严峻的挑战。肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是由汉坦病毒(Hantirus, HV)引起的一种自然疫源性疾病,在我国已有半个世纪的流行史,全国除青海、台湾省外均有疫情发生,啮齿类动物是病毒主要宿主。我国的HFRS主要是汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)和汉城病毒(Seoul virus, SEOV)所引起,前者的毒力要大于后者,所导致的临床症状也更为严重。本课题研究对象之一的宁波市位于我国的东南沿海,属于半潮湿气候环境,适合汉坦病毒宿主啮齿类动物的繁殖和生长,HFRS一直以来当地一种主要的自然疫源性疾病,疾病监测体系的完善和公共卫生的提高,自1997年以后,该市HFRS疫情呈逐年下降态势。但是近年来,HFRS又有死灰复燃的趋势,并在2009-2010年出现了疫情相对高发,,对宁波地区汉坦病毒流行株实验室检测和分子进化研究尚未见文献报道。新型甲型H1N1流感作为新发重大传染病于2009年3月17日在墨西哥、美国等国家发现并迅速传遍世界,引起全球的关注。据世界卫生组织2010年8月6日公布的最新疫情通报,截至2010年8月1日,214个国家报告了实验室新型甲型H1N1流感确诊病例,已造成至少18449人死亡。据中国卫生部通报,截至2010年1月10日,中国内地已有124764例甲型H1N1流感确诊病例,其中744例死亡。造成本次流感流行的新型甲型H1N1病毒是以北美猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)为基本骨架,与禽流感、欧亚大陆猪流感病毒等基因重排的结果,人群或很少对该型病毒具有免疫能力,且病毒极易在人和人之间传播。猪流感病毒基因在1930到1990年间只了较小的进化,但是,从上世纪90年代末期开始,人、禽和猪三者重排病毒开始在猪中出现,人感染猪流感病毒的病例呈不断增多的趋势,是与猪接触较为密切的养猪工人,但都呈散发,与此同时,猪流感病毒在人与人之间也罕见传播,因此猪源流感病毒从偶可感染人,到2009年的大规模暴发流行,其病毒分子必定了基因重排与选择性进化,对猪源流感病毒从散发到暴发流行进化的分析也具有的流行病学。研究目的:本研究旨在应用流行病学原理,现场监测、实验室处理和生物信息学方法探讨两种引起突发公共卫生事件病毒分子(汉坦病毒和新型甲型H1N1流感病毒)的生物进化,揭示宁波市汉坦病毒流行毒株和毒株的分子进化;探讨可导致人类感染的猪源甲型H1N1流感病毒从散发到流行的分子进化特征,并为公共卫生以及卫生防疫工作一定的理论依据。研究方法:,本研究宁波市疾病预防与控制中心近年HFRS疫情数据,探讨宁波市HFRS疫情的发病特点与规律,捕获汉坦病毒宿主啮齿类动物以及HFRS患者血清标本,应用Invitrogen公司的TRIzol? Reagent试剂盒和QIAGEN公司的QiAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取RNA分子,并应用promega A3500试剂盒和自设引物RT-PCR扩增汉坦病毒M片段基因,GenBank汉坦病毒M片段参考序列,使用MEGA4软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis VERSION 4),neighbor-joining (NJ)法构建进化树(bootstrap =1000 reppcates)。其次,本研究文献检索历史上报道过的人感染猪流感病例,并在GenBank上提取相应的各片段分子序列以及参考序列,分子生物学软件系统进化分析(phylogenetic analysis)、分子重排分析(bootscan analysis)和适应性进化分析(adaptive evolution analysis),揭示可导致人类感染的猪源甲型H1N1流感病毒从散发到流行的分子进化特征。研究结果:本研究共20例2009-2010年宁波市HFRS病人血清,4份汉坦病毒阳性鼠肺,20例血清经过RNA抽提和RT-PCR成功扩增出4例汉坦病毒M段基因,4例阳性鼠肺汉坦病毒M段基因都被成功扩出。,本研究PubMed检索出49例北美地区2009年之前散发人感染猪流感病例,其中14例病例在Pubmed上提交了基因序列,被本研究用于系统进化分析。1.宁波市汉坦病毒分子进化分析(1)宁波市HFRS疫情情况自二十世纪八十年代以来,宁波市HFRS疫情出现过2次高峰,次为1985～1987年,全市年发病数在600～800之间,年发病率为11.86～16.08/10万;次高峰为1991～1995年,全市年发病数在542～649之间,年发病率为10.40～12.71/10万,自1997年以后,宁波市HFRS疫情呈逐年下降态势。宁波市2010年共报告HFRS病例131例,报告发病率1.96/10万,死亡0例病例。与2009年(1.80/10万)相比,全市报告发病率上升8.89%。全年均有病例发生,发病曲线基本呈形态,其中12月份为全年发病最高峰,4月份为次高峰,8-10月份发病人数少,与我国南方地区HFRS的流行规律相符。发病年龄分布以20-60岁年龄组为主,占报告总数的77.10%,男女发病数分别为96人和35人,性别比为2.74:1。职业分布前三位分别为农民、工人、民工,共86人,占65.65%。媒介调查小家鼠和褐家鼠是当地HFRS主要的媒介生物。(2)RNA抽提和RT-PCR扩增结果宁波市疾病预防与控制中心共20例HFRS病人血清,2007年9月10-13日在宁波鄞州区横溪镇孔家潭村室内(A),奉化市西坞镇王府村室内(B),鄞州姜山后鄮村室内(C),奉化市方桥镇方桥村工厂区(D),鄞州姜山后鄮村西瓜大棚(E)捕获鼠63只,其中A14只,B6只,C13只,D14只,E16只,经鼠肺荧光抗原检测结果分析,其中阳性的鼠标本分别为D005(褐家鼠,活,雄),D008(褐家鼠,活,雄),D009(褐家鼠,活,雄),E002(黄胸鼠,活,雌)。20例HFRS病人血清经过RNA抽提和RT-PCR成功扩增出4例汉坦病毒M段基因(E1、E9、E19、E20),4例阳性鼠肺汉坦病毒M段基因都被成功扩出。(3)宁波市汉坦病毒流行毒株与基因进化结果在GenBank上共下载18例不同地区SEOV和4例HNTV参考序列的M片段基因用于系统进化分析。结果,从鼠肺中分离扩增的汉坦病毒M段基因D005, D008, D009, E002和从病人血清中分离扩增的M段基因E1, E9, E19, E20全部位于SEOV单元群中,与HNTV形成两个完全不同的进化枝,这宁波市汉坦病毒的流行株为SEOV。同源性分析,宁波市汉坦病毒M段基因与参考SEOV的同源性为94.7%-99.6%,与1984年在我国江西省分离的SEOV毒株L99有5.3%的核苷酸差异,与2007年黑龙江分离的SEOV毒株HLJ3-23的核苷酸差异仅为0.4%,但M段基因并随时间的推移出的进化差异(P0.1)。4例从鼠中分离的M基因与3例从人血清分离到的M基因的同源性为100%,只有1例从人血清分离到的M基因E20与其余7株有1.4%的核苷酸差异。结果,宁波市的汉坦病毒并未变异,至于E20与其余毒株的核苷酸差异,继续监测后续毒株以观察发生突变。2.可导致人类感染的猪源甲型H1N1流感病毒从散发到流行的分子进化(1)2009年之前可导致人类感染的猪流感病毒的分子特征包括2009年新型甲型H1N1流感病A/H1N1/2009、文献检索并在GenBank上下载到的历史上人感染猪流感病毒序列以及相应的不同年代不同地区不同宿主不同亚型的参考序列在内的系统进化,除了一株1998年在威斯康辛州从人体内分离到的毒株A/Wisconsin/10/98外,1970到1990年代感染人的猪流感病毒8段基因序列全部都和北美古典猪流感病毒序列接近。A/Wisconsin/10/98以及2005-2007年导致人类感染的猪流感病毒,PB2, PA基因与北美的禽流感病毒接近,PB1基因于人类季节性流感H3N2接近,HA, NP, NA, MP和NS基因则与北美古典猪流感病毒序列接近。(2)可导致人类感染的猪源甲型H1N1流感病毒从散发到流行的分子进化联系系统进化,2009年新型甲型H1N1流感病毒A/H1N1/2009聚集在一枝独特的进化枝上,PB2, PB1, PA, HA, NP和NS基因与在北美地区流行的可导致人类感染的三者重排猪流感病毒代表株A/Iowa/CEID23/2005 (H1N1)以及在2005年之后可感染人类的猪流感病毒对应的基因接近。NA和MP基因与在欧亚大陆流行的猪流感病毒的相应的基因接近。基因重排分析(Bootscan analysis)结果,2009年新型甲型H1N1流感病A/H1N1/2009与A/Iowa/CEID23/2005 (H1N1)在PB2, PB1, PA, HA, NP,和NS基因上的同源性最高,分别为95.3%,95.1%,95.2%,90.3%,95.2%和94.7%。2009年新型甲型H1N1流感病A/H1N1/2009的NA和MP基因与在欧亚大陆流行的猪流感病毒A/Swine/Spain/50047/2003 (H1N1)的同源性最高,分别为90.2%和94.4%。(3)可导致人类感染的猪源甲型H1N1流感病毒的适应性进化分析对决定流感病毒感染和传播能力起主要主用的3段基因(HA, NA, MP)序列适应性进化测试的结果,1998年之前可导致人类感染的猪流感病毒的HA基因到2005年至2009年间发生了主动选择进化,NI =0.817,但是,2005年至2009年间可导致人类感染的猪流感病毒HA基因到2009年新型甲型H1N1流感病毒A/H1N1/2009并未观察到主动进化,NI =1.077。,欧亚大陆猪流感病毒NA基因到2009年,发生了主动选择进化,NI =0.773,而MP基因却未发生主动选择性进化,NI =1.09。研究:对于引起公共卫生突发事件的两种RNA病毒,宁波市汉坦病毒流行株为SEOV且M段基因未发生变异,可导致人类感染的猪源甲型H1N1流感病毒从散发到流行的分子进化了两个比较关键的,于2005年左右完成了北美古典猪、北美的禽和人类季节性流感H3N2的三者基因重排,2009年引进了欧亚猪NA和MP基因,并且NA基因发生了主动选择进化导致了2009年疫情的暴发流行。监测宿主动物对控制公共卫生突发事件的发生具有。关键词：公共卫生突发事件论文汉坦病毒论文新型甲型流感病毒论文基因进化论文
摘要5-10
Abstract10-16
主要英文略缩词表16-17
前言17-23
宁波市汉坦病毒分子进化研究23-43
一、与方法23-30
二、结果30-40
三、讨论40-43
人类感染的猪源甲型H1N1 流感病毒从散发到流行的分子进化研究43-69
一、与方法43-46
二、结果46-49
三、讨论49-69